L’interno è imponente: oltre la navata centrale nel 1596 Mario Farnese fece ampliare la chiesa unendo la navata laterale con quattro altari. Spiccano nella Cappella del SS. Mo Sacramento il tabernacolo in legno dorato e marmi policromi donato da Monsignor Ferrante Farnese vescovo di Parma , nel 1603. Nella stessa cappella si fronteggiano due capolavori: sulla sinistra il San Michele arcangelo di Orazio Gentileschi, grandioso artista toscano influenzato da Caravaggio; a destra la Messa di Papa Paolo III Farnese attribuita a Anton Maria Panico, stretto seguace di Annibale Carracci. Due opere che raccontano il mecenatismo di Mario Farnese e la volontà di dotare il suo castello di opere dei maestri attivi nella Roma del tempo per grandi famiglie come gli stessi Farnese e gli ordini religiosi. Allo stesso contesto si ascrive l’altare della Madonna del Rosario con i misteri e due dipinti con San Giovanni Battista e San Sebastiano.
Nella navata centrale si segnala, sotto l’altare maggiore, la custodia delle reliquie di San Flavio martire patrono di Farnese fino al 1815, donate dal cardinale Gaspare Carpegna al principe Agostino Chigi nel 1694.